如何監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)？術(shù)后的ctDNA-MRD檢測(cè)

MRD（Minimal Residual Disease），即微小殘留病灶，是指癌癥治療后殘留在體內(nèi)的少量癌細(xì)胞（對(duì)治療無(wú)反應(yīng)或耐藥的癌細(xì)胞）。殘留的癌細(xì)胞數(shù)量可能很少，不會(huì)引起任何體征或癥狀（但它們有可能導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)），甚至無(wú)法通過(guò)傳統(tǒng)方法檢測(cè)到，例如在顯微鏡下觀察細(xì)胞和/或追蹤血液中的異常血清蛋白標(biāo)志物（腫瘤標(biāo)志物）；

MRD是一種生物標(biāo)志物，陽(yáng)性結(jié)果意味著癌癥治療后仍可檢測(cè)到殘留（剩余）病灶（發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞，癌癥治療后殘留的癌細(xì)胞會(huì)變得活躍并開(kāi)始繁殖，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)），陰性結(jié)果表示癌癥治療后未檢測(cè)到殘留（剩余）病灶（未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞，對(duì)血癌患者來(lái)說(shuō)是好事，研究表明MRD陰性與某些血癌更長(zhǎng)的緩解期和更長(zhǎng)的生存率有關(guān)）；

(資料圖片)

醫(yī)生可使用MRD來(lái)衡量治療的有效性，并預(yù)測(cè)哪些患者有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)：

可幫助醫(yī)生動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和確認(rèn)疾病的緩解情況，早期發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)跡象，并盡早開(kāi)始治療；

可告訴醫(yī)生初始治療效果如何，如果標(biāo)準(zhǔn)治療方案效果不佳，醫(yī)生會(huì)更改治療方案，以更有效地獲得疾病緩解；

基于ctDNA指導(dǎo)的MRD（微小/可測(cè)量殘留病灶或分子殘留病灶）評(píng)估，可優(yōu)于傳統(tǒng)的臨床或影像學(xué)方法鑒定出有MRD的患者，并在預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)等方面具有較高的靈敏度和特異性。

同時(shí)，手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)致細(xì)胞的死亡增加，與血液cfDNA的水平增加有關(guān)。

ctDNA僅占癌癥患者體內(nèi)cfDNA的一小部分，手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的野生型cfDNA釋放到血液循環(huán)中會(huì)使ctDNA的檢測(cè)變得復(fù)雜化。

從技術(shù)上講，野生型cfDNA的激增對(duì)任何用于ctDNA檢測(cè)的方法的技術(shù)靈敏度和特異性的要求也增加了。

因此，了解ctDNA檢測(cè)環(huán)境中野生型cfDNA的波動(dòng)至關(guān)重要，并應(yīng)注意避免cfDNA的水平升高。

癌癥手術(shù)創(chuàng)傷引起的cfDNA濃度增加對(duì)ctDNA有何影響？

1）cfDNA的半衰期約為2小時(shí)，盡管如此，手術(shù)創(chuàng)傷后的cfDNA濃度可能會(huì)持續(xù)數(shù)天甚至數(shù)周的升高，恢復(fù)到創(chuàng)傷前cfDNA水平的時(shí)間因創(chuàng)傷嚴(yán)重程度而異。

那么，手術(shù)后cfDNA水平是否一定會(huì)升高？如果升高一般多久會(huì)恢復(fù)到正常cfDNA水平？手術(shù)后何時(shí)采血進(jìn)行ctDNA檢測(cè)才更準(zhǔn)確？

2）cfDNA主要是通過(guò)細(xì)胞凋亡釋放，產(chǎn)生短的約為166bp大小的核小體DNA片段（又稱普通cfDNA）。

那么，手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的cfDNA是否具有類似的片段化大小？

如果手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的cfDNA片段化程度較低（或更長(zhǎng)），是否可以根據(jù)其片段大小將其與普通cfDNA（標(biāo)準(zhǔn)核小體cfDNA）分離，以避免創(chuàng)傷誘導(dǎo)的cfDNA對(duì)ctDNA檢測(cè)的影響？

3）創(chuàng)傷誘導(dǎo)的cfDNA是否會(huì)影響ctDNA-MRD的檢測(cè)？

這些問(wèn)題，在《Molecular Oncology》發(fā)表的一篇文章中，給出了解釋。

研究人員對(duì)436名結(jié)直腸癌（CRC）患者和47名肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（MIBC）患者在手術(shù)前和手術(shù)后6周內(nèi)收集配對(duì)血漿樣本中的cfDNA水平進(jìn)行了定量。

樣本采集：術(shù)前和術(shù)后采用10ml規(guī)格EDTA管進(jìn)行全血采集，并于2h內(nèi)兩次離心處理，將分離出的血漿置于-80℃保存。

cfDNA分離和定量：從8ml血漿樣本中純化cfDNA。CRC患者血漿樣本中的cfDNA拷貝數(shù)通過(guò)ddPCR進(jìn)行測(cè)定，該測(cè)定方法特異性針對(duì)Chr3和Chr7上的兩個(gè)高度保守區(qū)域；MIBC患者血漿樣本中的cfDNA通過(guò)Quant-iT高靈敏度dsDNA檢測(cè)試劑盒（Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit）進(jìn)行定量。

cfDNA大小描述：使用SPRI磁珠進(jìn)行cfDNA的短片段（

1kb）雙面選擇，分離的cfDNA大小在LabChip GX上進(jìn)行分析，并使用Quant-iT高靈敏度dsDNA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量。

ctDNA測(cè)量：從這些患者中選擇影像學(xué)證實(shí)復(fù)發(fā)的患者（n=25），對(duì)cfDNA掩蓋的ctDNA進(jìn)行分析，這些患者在手術(shù)后立即檢測(cè)ctDNA-MRD為陰性，并在第6個(gè)月前變?yōu)閏tDNA-MRD陽(yáng)性（n=8）。

cfDNA統(tǒng)計(jì)分析：將每位患者的術(shù)后cfDNA濃度標(biāo)準(zhǔn)化為術(shù)前cfDNA濃度。根據(jù)采血日期，術(shù)后數(shù)據(jù)以1周為間隔進(jìn)行分組分析。

主要研究成果

1. 手術(shù)創(chuàng)傷后cfDNA水平會(huì)升高，并在第4周后恢復(fù)至創(chuàng)傷前水平。

CRC患者術(shù)后cfDNA平均水平比術(shù)前高出3倍，MIBC患者術(shù)后的cfDNA平均水平則高出8倍（這可能表明與結(jié)腸或直腸切除術(shù)相比，膀胱切除術(shù)與更嚴(yán)重的創(chuàng)傷有關(guān)）。兩個(gè)患者隊(duì)列的cfDNA水平在術(shù)后持續(xù)升高時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4周（P=0.0005且P≤ 0.0001）。

為了研究cfDNA增加的持續(xù)時(shí)間，將兩個(gè)患者隊(duì)列的術(shù)后cfDNA水平繪制為時(shí)間函數(shù)，CRC患者手術(shù)創(chuàng)傷后第1周cfDNA增加最多（中位增加3.6倍），并在接下來(lái)的3周內(nèi)逐漸下降，然后在第五周恢復(fù)到創(chuàng)傷前水平。MIBC患者手術(shù)創(chuàng)傷后第1周cfDNA中位增加7.7倍，并在第2-3周達(dá)到最高水平，中位增加11.6倍，此后cfDNA逐漸下降，然后在第5~6周恢復(fù)到創(chuàng)傷前水平。

此外，術(shù)后cfDNA增加的發(fā)生與性別、年齡、UICC分期和腫瘤位置無(wú)關(guān)。

▲ 手術(shù)后cfDNA濃度的變化

▲ cfDNA濃度相對(duì)于術(shù)前水平的術(shù)后變化

手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致cfDNA水平升高長(zhǎng)達(dá)4周。

因此，在術(shù)后采血進(jìn)行ctDNA-MRD檢測(cè)時(shí)，應(yīng)仔細(xì)考慮采血時(shí)間，因?yàn)楹笃诓蓸哟蟠鬁p少了因手術(shù)創(chuàng)傷引起的野生型cfDNA污染的問(wèn)題。

如果延遲采血進(jìn)行ctDNA檢測(cè)不阻礙術(shù)后輔助治療決定的話，該策略是可行且有益的。

2. 手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的cfDNA片段大小約為166bp，與普通cfDNA大小一致

為了評(píng)估手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的cfDNA片段是否比普通cfDNA片段長(zhǎng)，對(duì)91名CRC患者確定了cfDNA短片段（

1kb）的大小和濃度，發(fā)現(xiàn)短片段cfDNA峰值大小約為166bp，與普通cfDNA（標(biāo)準(zhǔn)核小體cfDNA）大小一致。短片段cfDNA水平在第一周增加至中位數(shù)8.2倍，并在第2周逐漸下降，在第4（1.4倍）和第5周（1.1倍）達(dá)到術(shù)前水平。

相比之下，長(zhǎng)片段cfDNA的水平幾乎沒(méi)有變化。

▲ 不同血漿樣本短和長(zhǎng)片段cfDNA大小分布情況

▲ cfDNA短片段和長(zhǎng)片段的術(shù)后變化

術(shù)后cfDNA的增加是由與普通cfNDA或ctDNA大小相似的短片段cfDNA引起的，去除長(zhǎng)片段cfDNA不太可能減輕由手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的cfDNA帶來(lái)的問(wèn)題。

普通cfDNA和手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的cfDNA之間的大小相似，表明了cfDNA有一個(gè)共同的斷裂機(jī)制，最有可能是細(xì)胞凋亡。

3. 創(chuàng)傷誘導(dǎo)的cfDNA影響ctDNA的檢測(cè)，建議ctDNA-VAF LoD低于0.012%。

隨著手術(shù)創(chuàng)傷引起的cfDNA水平的增加，對(duì)任何用于ctDNA檢測(cè)的方法的技術(shù)靈敏度和特異性的要求也增加了。ctDNA檢測(cè)的可能性隨特定技術(shù)的ctDNA-VAF LoD而異。

ctDNA檢測(cè)的LoD越低，檢出的可能性越高，并且隨著術(shù)后cfDNA水平的逐漸下降，檢出的可能性也越高。

如果想要實(shí)現(xiàn)檢出>90%的樣本，ctDNA-VAF LoD必須低于0.012%，無(wú)論其采樣時(shí)間如何。

▲ cfDNA水平升高的樣本中的ctDNA檢測(cè)

由于只有少數(shù)ctDNA檢測(cè)技術(shù)擁有0.01%或更低的VAF檢測(cè)靈敏度。

因此，在ctDNA檢測(cè)環(huán)境中避免來(lái)自手術(shù)創(chuàng)傷引起的野生型cfDNA污染將是理想的選擇。

4. 縱向分析顯示，cfDNA水平升高會(huì)阻礙ctDNA-MRD檢測(cè)

共有25名患者在隨訪期間經(jīng)影像學(xué)證實(shí)復(fù)發(fā)，因此是ctDNA-MRD陽(yáng)性的候選者。

在手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的cfDNA期間，8名ctDNA-MRD陽(yáng)性，17名ctDNA-MRD陰性（其中6名第4周后沒(méi)有采集血液樣本被排除掉，其中3名手術(shù)后ctDNA絕對(duì)水平太低被排除掉，剩余8名ctDNA-MRD陰性患者可分析）。

縱向樣本分析顯示，手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的cfDNA釋放停止后不久，5名ctDNA-MRD陰性患者變?yōu)殛?yáng)性（在6個(gè)月前，8名ctDNA-MRD陰性患者全部變?yōu)閏tDNA-MRD陽(yáng)性）。

手術(shù)創(chuàng)傷引起的cfDNA增加可能阻礙了ctDNA-MRD的檢測(cè)。

▲ 5名患者的cfDNA濃度和絕對(duì)ctDNA VAF隨時(shí)間變化情況

手術(shù)后立即采血的ctDNA水平很可能太低（ctDNA絕對(duì)水平不足，此時(shí)腫瘤負(fù)荷最低），無(wú)論cfDNA濃度如何，任何ctDNA檢測(cè)技術(shù)都無(wú)法檢測(cè)到。

將術(shù)后血液樣本的采集推遲到第5周或更晚，屆時(shí)cfDNA水平有望恢復(fù)正常，將降低手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的野生型cfDNA稀釋ctDNA的可能性，ctDNA-MRD檢測(cè)將會(huì)更準(zhǔn)。

臨床上操作時(shí)，考慮到輔助治療的緊迫性，可以選擇盡早抽取血液樣本，例如在手術(shù)后第2周，然后在手術(shù)后5周再次抽取血液樣本。如果可以在早期血樣中檢測(cè)到ctDNA-MRD陽(yáng)性，則可以更快地啟動(dòng)輔助治療。

如果沒(méi)有，后面的血液樣本可以為ctDNA-MRD陰性患者的再次檢測(cè)提供更好的機(jī)會(huì)，因?yàn)榇藭r(shí)的ctDNA-VAF會(huì)更高。

總之，手術(shù)創(chuàng)傷與cfDNA水平升高有關(guān)，持續(xù)長(zhǎng)達(dá)4周，這可能掩蓋了復(fù)發(fā)患者的ctDNA。手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的cfDNA與普通cfDNA的大小相似。為了減輕手術(shù)創(chuàng)傷引起的cfDNA對(duì)ctDNA檢測(cè)的影響，建議在第4周后對(duì)最初ctDNA陰性的患者進(jìn)行第二次血液樣本分析。

參考資料：?

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文章來(lái)源：基因Talks、醫(yī)世象，內(nèi)容略有調(diào)整。

本文由醫(yī)世象 夏日整編，轉(zhuǎn)載聯(lián)系授權(quán)。

——本期完——

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